Vol. 2° -  XVIII.8.7.

Painting libraries
cromosomiche e subcromosomiche

L'insieme di tutti i vettori ricombinanti, che nel complesso coprono un intero cromosoma, rappresenta una libreria cromosoma specifica. I vettori di clonaggio più usati per la costruzione di una libreria sono i cosmidi e gli YAC, che a differenza dei plasmidi e dei fagi consentono di inserire larghi frammenti di DNA.

Le libraries cromosomiche possono essere costruite o mediante cell sorter (FACS) o partendo da ibridi cellulari uomo-hamster contenenti un solo cromosoma umano. Sottoponendo il DNA dell'ibrido ad amplificazione genica usando come primers sequenze Alu, specifiche dell'uomo, si amplifica la sola componente umana dell'ibrido. Il prodotto dell'amplificazione, usato come sonda per esperimenti di FISH su metafasi umane, colorerà solo l'intero cromosoma umano contenuto nell'ibrido.A causa dei riarrangiamenti che avvengono in vitro durante la formazione degli ibridi, questi ultimi possono ritenere, in aggiunta a cromosomi interi, uno o più frammenti cromosomici.

Il contenuto cromosomico umano dell'ibrido può essere caratterizzato ibridando prodotti marcati di Alu-PCR dell'ibrido su metafasi umane. Gli ibridi con frammenti cromosomici noti possono essere usati come painting libraries subcromosomiche. L'abbinamento tra painting libraries cromosomiche e subcromosomiche con YAC specifici di una data regione cromosomica, permette di caratterizzare in maniera fine riarrangiamenti cromosomici incontrati in citogenetica clinica o tumorale e consente di seguire riarrangiamenti avvenuti durante l'evoluzione. L'utilità di questo abbinamento è particolarmente evidente quando la regione cromosomica riarrangiata è talmente piccola da non poter essere identificata tramite i metodi convenzionali di bandeggio.

Inoltre, l'uso delle sole painting libraries cromosomiche fornirebbe indicazioni solo sul cromosoma riarrangiato e non sulla regione subcromosomica interessata e sui punti di rottura, mentre l'analisi con i soli YAC di un dato cromosoma richiederebbe molto tempo. L'uso combinato delle painting libraries subcromosomiche e degli YAC permette di restringere rispettivamente l'analisi ad una regione definita e di definire in maniera precisa la regione cromosomica riarrangiata. Questo può essere realizzato mediante esperimenti di coibridazioni in cui le due sonde (quella relativa alla painting library e quella relativa allo YAC), marcate per nick translation in maniera diversa (una con biotina e l'altra con digossigenina), sono ibridate insieme. Esse potranno essere distinte, in esperimenti di FISH, sullo stesso preparato metafasico.