Vol. 2° -  XVIII.8.4.

Mappe fisiche

Differenti tipi di mappa fisica, che descrivono l'ordine e la distanza tra due marcatori misurata in numero di nucleotidi (bp), variano nel loro grado di risoluzione, ossia nella precisione della localizzazione di una sonda. I metodi usati nella mappatura fisica si possono dividere in due categorie:

§ metodi a bassa risoluzione

§ metodi ad alta risoluzione.

8.4.a. Mappa fisica a bassa risoluzione

I sistemi di mappatura più usati utilizzano gli ibridi cellulari e la tecnica della ibridazione in situ.

8.4.b. Mappatura mediante ibridi cellulari

Cellule somatiche ibride interspecifiche derivano dalla fusione di cellule provenienti da specie differenti. Gli ibridi più usati per la mappatura derivano dalla fusione di cellule umane e di roditore, comunemente topo o hamster, indotta da sostanze chimiche, come il polietilenglicole, in grado di creare dei pori a livello della membrana plasmatica.

Le cellule ibride che inizialmente tendono a perdere in maniera casuale e progressiva cromosomi umani, in seguito si stabilizzano fino a contenere il set cromosomico del roditore e il cromosoma umano che assicura un vantaggio selettivo all'ibrido, insieme a cromosomi ritenuti casualmente. Dopo aver selezionato le cellule ibride e averle caratterizzate dal punto di vista cariotipico, si allestisce un pannello di ibridi, dato dall'insieme delle cellule ibride il cui contenuto cromosomico umano nel complesso corrisponde all'intero set cromosomico dell'uomo.

Tale pannello è usato per studi di mappatura. Gli ibridi cellulari sono stati utilizzati inizialmente per mappare geni di cui si conosceva il prodotto (proteine enzimatiche o strutturali). Sugli estratti proteici delle cellule ibride si esegue una corsa elettroforetica su gel. Il gel si usa in seguito o per far avvenire una reazione enzimatica catalizzata dall'enzima il cui gene si vuole mappare, in presenza di un cromogeno, o per far avvenire (in caso di proteine non enzimatiche) una reazione di precipitazione usando anticorpi contro la proteina stessa.

Se la cellula ibrida non ha ritenuto il cromosoma su cui mappa il gene codificante, non si avrà reazione colorimetrica o di precipitazione. Un limite di questa applicazione è dato dal fatto che, essendo il topo o l'hamster e l'uomo due specie affini, potrebbero esserci problemi nel discriminare tra la reazione, colorimetrica o di precipitazione, dovuta a proteine umane e quella relativa a proteine murine.  

Oggi, grazie all'avvento delle tecniche di DNA ricombinante, è possibile mappare qualsiasi segmento clonato indipendentemente dalla sua espressione. Digerendo il DNA estratto dai cloni ibridi con enzimi di restrizione, eseguendo un blotting e ibridando con la sonda a disposizione, è possibile localizzarla su un dato cromosoma, calcolando l'indice di concordanza, ossia il rapporto percentuale tra gli ibridi positivi per la sonda in esame e gli ibridi totali. Usando un enzima in grado di discriminare tra la banda di ibridazione umana e murina, si può riconoscere l'eventuale segnale di ibridazione proveniente dalle cellule di roditore.

Un limite della mappatura mediante ibridi che contengono solo cromosomi umani interi è che non si può definire la posizione subcromosomica. Questo limite può essere superato utilizzando ibridi che contengono frammenti di un dato cromosoma, ottenuti dalla fusione di cellule di roditore e cellule ibride contenenti un solo cromosoma umano e irradiate, o ibridi ottenuti da cellule parentali umane provenienti da pazienti con riarrangiamenti cromosomici.

8.4.c. Ibridazione in situ fluorescente (FISH)

L'ibridazione in situ non radioattiva permette di localizzare direttamente una sonda, marcata in modo non radioattivo, sulla corrispondente regione cromosomica. Le sonde, clonate in plasmidi, fagi, cosmidi o YAC (Yeast Artificial Chromosomes) , possono essere facilmente associate con particolari bande (identificabili attraverso colorazioni citogenetiche), ottenendo una mappa detta citogenetica o cromosomica. Il numero di paia di basi contenute in una banda può essere solo stimato.

Finora anche la migliore mappa cromosomica può essere usata solo per localizzare frammenti di DNA in una regione di circa 10Mb, la misura di una tipica banda vista su un cromosoma. Tecniche ad alta risoluzione, le quali permettono di ottenere cromosomi in prometafase, possono incrementare la risoluzione di mappa di circa 0.1Mb.

Se la sonda usata per l'ibridazione in situ è un cDNA si ottiene una mappa, detta mappa cDNA, che mostra la posizione di regioni di DNA espresse (esoni) relative a particolari regioni o bande cromosomiche. Queste regioni di DNA sono trascrivibili in mRNA. Il cDNA è sintetizzato in laboratorio usando mRNA come template; questo cDNA può essere quindi mappato su regioni genomiche. Poiché esse rappresentano regioni genomiche espresse, i cDNA identificano le parti del genoma con maggiore interesse biologico e medico. Una mappa cDNA può fornire la localizzazione cromosomica per geni le cui funzioni sono attualmente sconosciute. Integrando mappe cDNA e mappe genetiche di linkage si può testare la localizzazione di un ipotetico gene responsabile di una malattia.

8.4.d. Mappa fisica ad alta risoluzione

Con determinate tecniche si possono mappare sequenze di DNA con una risoluzione da 1 bp a molte Mb. Le mappe fisiche ad alta risoluzione sono fondamentalmente basate su due approcci: collezione di frammenti clonati di DNA provenienti da un intero cromosoma o parti di esso (genoteche totali o parziali).

Le mappe possono essere prodotte identificando cloni che hanno inserti di DNA che si sovrappongono. Si cerca di ottenere un contiguo, ossia una serie di cloni overlappanti che coprano una intera regione cromosomica. Questi cloni rappresentano la base di partenza per analisi più dettagliate fino a livello di sequenza (analisi per elettroforesi di frammenti di DNA ottenuti mediante digestione con enzimi di restrizione rare cutter che producono macroframmenti).

Per frazionare grossi frammenti di restrizione prodotti è necessario utilizzare una particolare tecnica di elettroforesi in campi pulsati e diversamente orientati (PFGE - Pulsed field gel elctrophoresis. Il risultato di questa tecnica è dato dall'ordine e distanza tra siti tagliati da suddetti enzimi. Questo approccio produce mappe con maggiore continuità e pochi gaps tra i frammenti rispetto alle mappe costruite usando contigui, anche se la risoluzione è più bassa.  

Esistono diversi vettori per il clonaggio molecolare come i plasmidi, in grado di contenere frammenti fino a 10 Kb, fagi, che possono contenere frammenti fino a 40 Kb, e cosmidi in grado di contenere frammenti fino a 100 Kb. Per la mappatura fisica su larga scala è necessario organizzare contigui che coprano estese regioni cromosomiche. Tale obiettivo risulta tanto più facilmente realizzabile quanto più grandi saranno i frammenti clonati.

Lo sviluppo dei cromosomi artificiali di lievito (YAC) come vettori di clonaggio, mediante i quali è possibile isolare frammenti di DNA dell'ordine di grandezza di 1 Mb, ha dato un notevole contributo alla soluzione di questo problema. Per identificare YAC di una data regione cromosomica in modo da costruire un contiguo, si possono usare delle sequenze nucleotidiche note, lunghe da 200 a 500 bp, distribuite su tutta una regione genomica o su tutto il genoma dette STS (Sequence Tagged Site).

È stata costruita una mappa mostrando l'ordine e la distanza degli STS. La mappa con gli STS può essere rappresentata elettronicamente e conservata in una banca dati facilmente accessibile. Un STS identifica in maniera univoca un qualsiasi tratto di DNA e pertanto un laboratorio che voglia clonare uno specifico frammento genomico, dovrà semplicemente consultare un computer per conoscere le due sequenze STS che delimitano questo frammento. Usando due primers corrispondenti alle due sequenze STS, si potrà amplificare mediante PCR il frammento e successivamente clonarlo.

Poiché nella reazione di amplificazione l'enzima usato non riesce ad amplificare frammenti superiori a 1.000 bp, i primers scelti, corrispondenti alle due sequenze STS che delimitano il frammento da clonare, non devono distare più di 1.000 bp. Poiché ogni elemento mappato (cloni, contiguo, sequenza) è definito da un unico STS, la mappe con gli STS sono molto utili per identificare e combinare dati di mappatura ottenuti da differenti strategie. Per identificare tra le sequenze di DNA umano quelle corrispondenti a geni sono usati particolari STS chiamati EST (Expressed Sequence Tags), ottenuti scrinando libraries di cDNA, che riconoscono sequenze trascritte. Infatti una applicazione degli EST include la localizzazione di geni lungo i cromosomi e l'identificazione di regioni codificanti nel genoma umano.