Vol. 2° -  XVIII.2.7.

Polymerase Chain Reaction - pcr

Metodica in vitro di tipo enzimatico usata per replicare ripetutamente e in modo selettivo brevi sequenze di DNA da una miscela di DNA, evitando i lenti procedimenti di clonaggio attraverso i plasmidi. È pertanto un punto di partenza comune a tutte le successive tappe analitiche di ingegneria genetica, come il blotting e l’analisi degli RFLP. Il suo unico limite consiste nel fatto che deve essere almeno in parte nota la sequenza del DNA da replicare.

Certamente la PCR, o Reazione a Catena della Polimerasi, è importante sia come tecnica applicativa che d’indagine, in quanto si tratta d’un metodo che permette una rapida ed elevata amplificazione in vitro di specifiche sequenze di DNA. Essa consente di sintetizzare in poche ore oltre un milione di copie di uno specifico oligonucleotide, rendendo possibile l’identificazione di quantità estremamente piccole di DNA con importanti applicazioni nella diagnostica.

Questa reazione riesce ad attivare in provetta lo stesso processo di duplicazione del DNA che si verifica nelle cellule vive. Partendo da una sequenza di DNA conosciuta, vengono sintetizzati chimicamente due frammenti di DNA lunghi una ventina di nucleotidi che funzionano da innesco, o attivatori, complementari ai due filamenti del DNA da amplificare. Gli oligonucleotidi che fungono da primers sono necessari in quanto l’enzima di sintesi impiegato nella PCR è in grado di lavorare su uno stampo solamente se ha già a disposizione i due estremi del tratto da neosintetizzare. La reazione viene realizzata ripetendo più cicli costituiti da tre fasi diverse:

ΠDenaturazione: nella prima fase le due eliche del DNA da amplificare vengono separate per effetto di elevate temperature.

 Ibridazione: nella seconda fase i due DNA attivatori, presenti in largo eccesso, si ibridano con le sequenze complementari del DNA bersaglio a temperature basse.

Ž Estensione: nella terza e ultima fase vengono sintetizzati due nuovi filamenti di DNA complementari alla sequenza bersaglio a partire dalle due molecole di innesco e dai precursori (nucleotidi trifosfati), grazie all’enzima DNA polimerasi.

Ripetendo 25-40 cicli delle tre operazioni descritte, si ottengono diversi microgrammi della sequenza desiderata a partire anche da una sola molecola di DNA bersaglio, con un’amplificazione dell’ordine di cento milioni di volte.

Intorno al 1995, grazie allo sviluppo di apparecchiature dedicate e di speciali strumenti in cui le variazioni cicliche della temperatura sono controllate da un microprocessore programmabile, è stato possibile automatizzare le operazioni, che sono divenute estremamente semplici e rapide. Grazie alla PCR è possibile oggi amplificare frammenti di DNA evitando il laborioso e complesso clonaggio in cellule ospiti mediante plasmidi o virus. Un altro dei grandi vantaggi della PCR, rispetto alle procedure tradizionali, è costituito dal notevole aumento di sensibilità che si può ottenere: è possibile ad esempio amplificare il DNA di una singola cellula o di frammenti cromosomici microdissezionati o di un frammento di una singola copia di un genoma virale, come quello dell’AIDS. Inoltre la PCR può essere eseguita a partire da piccole quantità di materiale non purificato, come ad esempio il DNA presente in un singolo capello o nelle tracce di saliva di un mozzicone di sigaretta o in resti archeologici e fossili.

2.7.a. Applicazioni della PCR

Le numerose applicazioni della PCR riguardano i settori della ricerca di base, la genetica evolutiva e di popolazioni, la diagnostica di malattie genetiche e infettive, nonché la medicina legale. Utilizzando la PCR è possibile inoltre studiare i DNA di organismi del passato conservati nei musei o rinvenuti in particolari condizioni di fossilizzazione. Si è riusciti per esempio ad amplificare una corta sequenza di circa 300 coppie di basi a partire dal DNA estratto da un coleottero fossile di 135 milioni d’anni fa conservato nell’ambra.

Nella diagnostica medica, con la PCR dovrebbe essere possibile individuare qualsiasi tipo di difetto genico o di agente infettivo. Le potenzialità della PCR in questo campo dovrebbero presto permettere di conoscere in ogni individuo quali sono i fattori di rischio ambientale per lo sviluppo di malattie genetiche molto diffuse.

Per quel che riguarda l’individuazione del genoma di agenti infettivi, come il virus dell’AIDS o i virus delle varie forme di epatite, le procedure basate sulla PCR sono molto più rapide e sensibili di quelle tradizionali e permettono di identificare gli individui infetti prima che questi diventino sieropositivi.

È recente l’impiego della PCR per titolare l’RNA del virus dell’epatite C, in quanto in almeno la metà dei casi di quest’epatite la trasmissione verticale madre-figlio sembra possibile. Attraverso tipizzazione dei ceppi materni e di quelli infantili con tecniche genomiche e analisi delle sequenze, si è calcolato che il rischio di trasmissione verticale esiste al 6%. Naturalmente, le ricerche sul genoma dei virus isolati da madre e figlio hanno dimostrato un’identità pari al 97-99%.

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