Vol. 2° -  XVIII.3.

sguardo riassuntivo

Il DNA ricombinante viene creato prelevando un frammento di DNA da un organismo per inserirlo in un vettore di clonazione. Un vettore di clonazione è una molecola di DNA capace di replicarsi in un ospite, come un batterio. In seno a questa molecola di DNA, un gene o una porzione di DNA può essere inserita in posizione nota. La molecola risultante viene introdotta in un ospite come l’Escherichia coli, il lievito, le cellule animali o vegetali. La duplicazione della cellula ospite dà luogo alla replicazione, o clonazione molecolare, della molecola di DNA ricombinante, producendone così molte copie che possono venir impiegate a scopo di studio o di manipolazione.

La formazione del DNA ricombinante, detta anche unione di geni, è una procedura attraverso la quale segmenti di materiale genetico vengono trasferiti da un organismo a un altro. Questa tecnica si basa sull’uso degli enzimi di restrizione, in grado di scindere frammenti di DNA ovunque esistano certe sequenze di nucleotidi. Questo procedimento dà luogo a una serie di frammenti di DNA del donatore che possono essere combinati con frammenti simili provenienti da un altro organismo. Nella maggior parte delle situazioni sperimentali i frammenti di DNA del donatore vengono combinati con virus, oppure vengono uniti a plasmidi, che sono quei piccoli anelli di DNA capace di autoreplicarsi. I vettori, siano essi virus oppure plasmidi, trasportano i frammenti di DNA del donatore dentro alla cellula prescelta. La combinazione del vettore col DNA del donatore costituisce la molecola di DNA ricombinante.

Una volta giunta nella cellula designata, questa molecola si replica insieme al DNA dell’ospite ogni volta che l’ospite si divide. Le divisioni cellulari producono un clone di cellule identiche, dotate ognuna di una copia di molecola di DNA ricombinante, capaci inoltre di tradurre il frammento di DNA del donatore nelle proteine da esso codificate. Come abbiamo appena visto, nel 1985 è stata messa a punto una procedura più efficiente, la PCR, in grado di produrre due doppie eliche di composizione identica a quella del DNA di partenza.

Gli enzimi di restrizione riconoscono, nel contesto del DNA, specifiche coppie di sequenze nucleotidiche e tagliano il DNA all’interno della sequenza di riconoscimento o in un punto vicino. Poiché tagliano il DNA in siti specifici, gli enzimi di restrizione vengono generalmente usati negli esperimenti di clonazione di DNA da ricombinare.

Come abbiamo visto, sono stati sviluppati diversi tipi di vettori di clonazione per costruire e clonare molecole di DNA ricombinante. Tutti i vettori di clonazione devono replicarsi nell’ospite, devono avere uno o più siti di restrizione in cui sia possibile inserire il DNA estraneo e devono possedere uno o più marcatori selettivi dominanti per poter visualizzare le cellule contenenti i vettori. Tra le classi principali di vettori dobbiamo citare anche i cosmidi [1] .

Le banche genomiche sono collezioni di cloni che contengono una copia di ogni sequenza di DNA del genoma di un organismo. Le banche genomiche sono utili, ad esempio, per isolare specifici geni e studiare l’organizzazione del genoma.

Dopo l’isolamento degli mRNA eucariotici dalle cellule, abbiamo visto che è possibile eseguire delle copie di DNA partendo dalle molecole di mRNA. Le copie di DNA risultanti sono dette cDNA, e i cDNA possono venir clonati usando appositi vettori di clonazione. Impiegando sistemi diversi si possono identificare sia specifiche sequenze in banche genomiche sia i cDNA. Questi sistemi prevedono l’uso di sonde specifiche per il DNA o per il cDNA.

Sia i geni che le sequenze di DNA clonati possono venir analizzati per determinare l’ordine e la specifica collocazione di siti di restrizione, processo che è detto mappatura per restrizione. I trascritti genici possono venir analizzati qualitativamente e quantitativamente usando le procedure del DNA ricombinante. Sono stati sviluppati metodi rapidi per determinare la sequenza di frammenti di DNA clonati, e uno di essi consiste nella procedura di Maxam-Gilbert che usa specifici reagenti chimici per modificare e tagliare la catena di DNA a livello di nucleotidi specifici.

La PCR usa oligonucleotidi sintetici per amplificare molte migliaia di volte uno specifico segmento di DNA in un sistema automatizzato. Uno dei maggiori vantaggi offerti dalla PCR consiste nelle piccolissime quantità di DNA necessario, e si può così amplificare il DNA di una singola cellula. Questa tecnica viene sempre maggiormente impiegata sia nella ricerca che in campo commerciale, compresa la produzione di specifici segmenti di DNA per clonazione o sequenziamento, nonché l’amplificazione del DNA per la ricerca di specifici difetti genetici.

Esistono molte applicazioni per la tecnologia del DNA ricombinante e procedure connesse. Per esempio, usando sonde appropriate, è possibile individuare specifiche malattie genetiche e sono stati messi a punto numerosi prodotti utili in campo clinico, veterinario e agricolo. Il progetto per il sequenziamento dell’intero genoma umano è stato portato a termine nel 2000 e fu annunciato dalla società americana Celera Genomics il 6 aprile.

Ma Francis Collins ribatte: ci vorranno ancora almeno 2 anni per un sequenziamento totale, che per ora ha raggiunto il 97%. Le future conoscenze saranno in grado di ampliare notevolmente la nostra comprensione della genetica umana. Con il continuo progresso dell’ingegneria genetica vegetale ben presto si otterranno molti tipi migliorati di piante coltivate con aumentata produttività e resistenza alle malattie.