Vol. 2° -  III.5.

IL NUCLEOLO

Il nucleolo è un organulo responsabile della sintesi degli acidi ribonucleici dei ribosomi, presente nel nucleo durante le fasi G1, S e G2. Scompare durante la mitosi.

Il numero dei nucleoli eguaglia di solito il grado di plodia: ci sono 2 nucleoli nelle cellule diploidi, 1 nelle aploidi, 4 nelle tetraploidi e così via. Spesso però i due nucleoli di una cellula diploide possono fondersi in un’unica struttura, oppure possono esservi numerosi nucleoli per cellula, come accade per le cellule germinali di vari animali.

Negli oociti degli anfibi, muniti di un nucleo enorme, ci sono migliaia di nucleoli disposti alla periferia del nucleo, al di sotto dell’involucro nucleare.

Al microscopio ottico il nucleolo si presenta come un granulo molto rifrangente, rotondeggiate oppure ovalare, situato in posizione eccentrica, in rapporto con masserelle di eterocromatina (eterocromatina nucleolo-associata) che lo circondano più o meno completamente in forma d’anello.

Il nucleolo si presenta con le seguenti strutture:

Ø cromatina perinucleolare, che si dispone a fascia, circondando più o meno completamente il corpo del nucleolo. Questa cromatina perinucleolare presenta proprietà fisiche singolari che permettono di isolare i nucleoli intatti ricorrendo all’ultracentrifugazione. Il calcio indurisce questa zona di cromatina e, in assenza di calcio, il nucleolo si gonfia e perde le sue caratteristiche morfologiche.

Ø corpo nucleolare, in genere sferico, che corrisponde alla porzione di nucleolo circondata da cromatina perinucleolare.

Fig. III. 22 - Nucleolo in un nucleo intercinetico. La cromatina di un determinato cromosoma, in un’area per lo più compresa fra due tratti di eterocromatina detta nucleolo-associata, presenta una sequenza di alcune centinaia di geni a forma di spazzolino che costituiscono la porzione fibrillare o interna del nucleolo (F).  
La porzione granulare del nucleolo (G) è formata dai complessi di rRNA e proteine, precursori delle unità ribosomiali maggiori e originati dalla porzione fibrillare.

Colorato con azzurro C o con blu di toluidina, il nucleolo si presenta come un granulo denso, omogeneo, con diametro medio di 1-2 mm nelle cellule normali. Allorché in profase si rendono visibili i cromosomi, si può constatare che il nucleolo aderisce a una certa area di un determinato cromosoma.

Al momento della scomparsa del nucleolo, tale area si presenta come un sottile tratto filamentoso in seno all’eterocromatina del cromosoma: quest’area è detta organizzatore nucleolare, NOR, in quanto è proprio qui che in telofase si riforma il nucleolo scomparso durante la mitosi. In realtà l’organizzatore nucleolare corrisponde alla pars fibrillaris del nucleolo. Talora si dà il nome di organizzatore nucleolare anche all’intero cromosoma che contiene l’area di cui abbiamo appena parlato.

L’organizzatore nucleolare spesso si trova nei pressi di una delle estremità del cromosoma dove si nota, in tal caso, un sottile tratto filamentoso recante appesa la parte distale del cromosoma sotto forma di granulo, detto satellite.

Oggi, però, col termine di satellite si indicano sempre più frequentemente certe frazioni di DNA altamente ripetitivo che non hanno nulla a che fare col nucleolo. Nella specie umana le cellule diploidi hanno ben 10 cromosomi muniti di tale organizzatore; raramente però hanno 10 nucleoli, perché alcuni organizzatori si fondono tra loro, altri invece restano inattivi non collaborando alla formazione dei nucleoli.

5.1. Biochimica del nucleolo

5.1.a. DNA nucleolare

La replicazione del DNA nucleolare avviene durante la fase S del ciclo cellulare. La replicazione del DNA perinucleolare è più precoce e più rapida rispetto a quella del DNA intranucleolare.

5.1.b. RNA nucleolari

Nel nucleolo esistono diversi tipi di RNA che vengono classificati a seconda del loro coefficiente di sedimentazione espresso in unità Svedberg. Nei nucleoli delle cellule epatiche si trovano i seguenti RNA: RNA 45S, 35S, 28S, da 8 a 16S, da 4 a 7S, infine il 18S, isolato dal nucleoplasma. I differenti RNA corrispondono a tappe maturative.

5.1.c. Proteine nucleolari

Il nucleolo contiene due tipi di molecole proteiche: proteine acide e istoni. Le loro funzioni sono poco conosciute.

5.1.d. Enzimi nucleolari

Nel nucleolo esistono enzimi che intervengono in importanti processi biochimici di sintesi e maturazione dell’RNA.

5.2. Ruolo del nucleolo

5.2.a. Trascrizione dell’RNA ribosomiale ó rRNA

Ricorrendo a esperimenti di citofisiologia comparata diventa talora facile comprendere un meccanismo biologico di interesse generale.

Tra i vari tipi di Xenopus laevis, un rospo africano, ne esiste uno che possiede un solo nucleolo, mentre abitualmente lo Xenopus laevis possiede due nucleoli per nucleo. La presenza di un solo nucleolo è una caratteristica ereditaria: se si incrociano due rospi con cellule dotate di un solo nucleolo, il 25% della progenie di girini possiede nuclei con due nucleoli, il 50% nuclei con un nucleolo e il 25% nuclei senza alcun nucleolo.

L’ultimo gruppo muore dopo quattro giorni dalla nascita, ma la vita dei morituri è lunga quanto basta per realizzare il seguente esperimento: si pongono i tre tipi di girino in un mezzo contenente precursori radioattivi dell’RNA. I girini con 1 o 2 nucleoli incorporano i precursori e sintetizzano RNA messaggero, RNA transfer e RNA ribosomiale; quelli con nuclei sprovvisti di nucleolo sintetizzano solo RNA messaggero e RNA transfer. Quindi i girini senza nucleolo hanno perso la possibilità di sintetizzare rRNA. Le zone fibrillari sono la sede in cui avviene la sintesi di RNA, e ciò è in perfetto accordo con l’osservazione che tali zone sono strettamente giustapposte al materiale cromosomico.

5.2.b. La maturazione dell’rRNA

Il DNA nucleolare che serve da stampo per la sintesi dell’rRNA è una porzione di DNA del cromosoma che si trova nell’organizzatore nucleolare, a livello della porzione fibrillare. Il nome di rDNA, o DNA ribosomiale, spetta ai geni responsabili della sintesi di rRNA corrispondente all’rRNA 45S.

Questo precursore, in seguito a maturazione, dà origine a una molecola di RNA 18S e a un’altra di 28S, entrambe metilate e associate a proteine ribosomiali. Tali particelle di RNP ribosomiali (40S per l’RNA 18S, 65S per l’RNA 28S) passano nel citoplasma attraverso i pori nucleari per associarsi e formare i ribosomi.

5.2.c. Regolazione della trascrizione dell’rRNA

La trascrizione di rRNA dipende dalla quantità di ribosomi presenti nel citoplasma. La tioacetamide (CH3 CSH3) stimola la sintesi di rRNA, che risulta 10 volte superiore a quella di cellule non trattate; provoca inoltre lesioni lisosomiali con liberazione progressiva di enzimi, quali proteasi e ribonucleasi, portando a una distruzione di ribosomi che diminuiscono del 50-70% e conseguente ipertrofia del nucleolo da aumentata produzione di rRNA. La regolazione dell’attività nucleolare si basa sulla seguente ipotesi: esisterebbe un sistema di retroazione, o feedback, per cui un prodotto ribosomiale o gli stessi ribosomi potrebbero funzionare da repressori genici con sblocco dell’inibizione in seguito alla loro distruzione.

5.2.d. Nucleolo e mRNA

Un nucleolo funzionante è necessario per il trasferimento dell’mRNA dal nucleo al citoplasma. L’inattivazione del nucleolo con un microfascio di luce UV inibisce il passaggio di mRNA in seno al citoplasma.

5.2.e. Preparazione alla mitosi

Il nucleolo è necessario per un corretto svolgersi della mitosi. In effetti, importanti alterazioni dei nucleoli provocano il blocco delle cellule in fase G2, che precede la mitosi o fase M. Il trattamento del nucleolo con un microfascio di luce UV inibisce la divisione cellulare. Se durante l’interfase e subito prima della scomparsa del nucleolo la sintesi proteica è bloccata con acticromo o con cicloesimide, la mitosi ha luogo, ma i nuclei non possono riformarsi.

5.3. Effetti delle variazioni del nucleolo nel Pollo

Le variazioni a carico delle dimensioni del nucleolo sono comuni sia nell’uomo che negli altri animali. Nonostante ciò, non è ancora chiaro il significato nonché la causa di tali variazioni. Le copie di geni che nei vertebrati codificano gli RNA ribosomiali, o rRNA 18S, 5.8S e 28S, sono numerose e sono raggruppate in corrispondenza di parecchi siti cromosomici, noti come regioni dell’organizzatore nucleolare o NOR.

I ribosomi vengono prodotti in questi siti in seguito alla trascrizione dell’rDNA, o DNA ribosomiale, sotto forma di rRNA e successiva formazione delle subunità preribosomiali. I geni per l’rRNA sono presenti in numero molto elevato: circa 400 nella Drosofila, nel pollo e nell’uomo, 1.000 negli anfibi, 10.000 nelle piante. Questo numero elevato garantisce il meccanismo dell’abbondante produzione di rRNA indispensabile alla sintesi proteica e alla divisione cellulare, ed è una caratteristica costante di gran parte dei genomi. Proprio a causa della funzione strutturale e catalitica svolta durante la sintesi proteica, gli rRNA suddetti sono essenziali per la differenziazione, lo sviluppo e la crescita.

Anche se è noto il numero di geni codificanti per l’rRNA, non è ben chiaro cosa possa accadere allo sviluppo e alla vitalità dei vertebrati omeotermi quando si verificano delle variazioni, specialmente in caso di riduzione numerica dei geni codificanti. A questo scopo Delany e coll. (1994) hanno studiato il potenziale di sviluppo in embrioni di pollo caratterizzati da ben definite deficienze numeriche a carico dei geni per gli rRNA. I risultati sono stati ottenuti impiegando un ceppo caratterizzato da un polimorfismo a carico delle dimensioni del nucleolo, che riflette a sua volta il polimorfismo delle dimensioni dei raggruppamenti di rDNA.

Gli embrioni caratterizzati da un nucleolo grande e da un nucleolo molto piccolo (Pp) sono eterozigoti per un raggruppamento ridotto di rDNA (+/p¹) e contengono circa il 66% dell’equivalente per i geni dell’rRNA degli individui normali (+/+), i quali sono dotati di due nucleoli di dimensioni normali e identiche (PP). Gli embrioni +/p¹ si sviluppano e crescono in modo regolare.

Gli embrioni con due nucleoli molto piccoli (pp) sono omozigoti per la deficienza di rDNA (p¹/p¹) e contengono circa il 45% dell’rDNA. Questi embrioni si arrestano in fasi molto precoci di sviluppo, e precisamente in fase di gastrula. Le ricerche hanno anche dimostrato che per raggiungere il successivo stadio di blastula sono necessari e cruciali adeguati livelli di rRNA. Gli eterozigoti Pp riescono a formare quantità adeguate di rRNA. Nel Gallus domesticus i raggruppamenti di rDNA hanno una dimensione e un’organizzazione molecolare simile a quella dei mammiferi, e tutti i geni per l’rRNA risiedono su un singolo paio di cromosomi. Nel pollo i loci dell’organizzatore nucleolare occupano circa 6.000 kb del braccio lungo del microcromosoma 17. L’altro braccio di questo cromosoma è occupato dal Complesso Maggiore di Istocompatibilità o locus B. I loci dell’organizzatore e il locus B distano circa 10 kb.

Fig. III. 23 - Microcromosoma 17 del pollo. I loci dell’organizzatore nucleolare, o NOR, occupano circa 6.000 kb del braccio lungo. L’altra porzione del cromosoma è occupata dal locus B o Complesso Maggiore di Istocompatibilità, che dista dal primo circa 10 kb.