Vol. 2° -  XIX.7.

misurazione della variabilità genetica con RFLP
e sequenziamento del DNA

Attualmente le tecniche di genetica molecolare forniscono i mezzi per esaminare la variabilità genetica direttamente sul DNA al fine di stabilire inequivocabilmente la quota di variabilità genetica presente nelle popolazioni naturali. Una di tali tecniche per rilevare la variabilità genetica utilizza gli enzimi di restrizione che producono tagli a doppio filamento sul DNA a livello di sequenze specifiche.

La maggior parte degli enzimi di restrizione riconoscono una sequenza di 4 oppure di 6 basi. Ad esempio, l'enzima di restrizione BamHI riconosce la sequenza GGATCC/CCTAGG. Ogni qualvolta questa sequenza è presente sul DNA, BamHI ne taglia la molecola. I frammenti risultanti possono venire separati con elettroforesi su gel di agarosio e osservati colorando il DNA o adoperando sonde per geni specifici.

Supponiamo che due individui differiscano per uno o più nucleotidi in una data sequenza di DNA e che tali differenze siano presenti in un sito di riconoscimento per un enzima di restrizione. Uno degli individui possiede una molecola di DNA che contiene il sito di restrizione, l’altro individuo invece no, in quanto la sequenza nucleotidica del DNA è diversa. Se si digerisce il DNA di questi due individui con l'enzima di restrizione e si separano su gel i frammenti risultanti, i due individui producono profili dei frammenti che sono diversi. Questi profili su gel sono denominati Restriction Fragment Lenght Polymorphism o RFLP, cioè polimorfismi nella lunghezza dei frammenti generati mediante digestione con endonucleasi di restrizione, e indicano che le sequenze di DNA dei due individui sono diverse.

Gli RFLP vengono ereditati allo stesso modo degli alleli che codificano per altri caratteri, però gli RFLP non producono un fenotipo visibile direttamente. I loro fenotipi sono rappresentati dai profili dei frammenti prodotti su gel quando il DNA è digerito dall'enzima di restrizione. Gli RFLP possono essere usati come marcatori genetici per la mappatura dei geni e possono inoltre fornire informazioni su come le sequenze di DNA siano diverse tra i vari individui. Tali differenze comprendono soltanto una piccola parte del DNA, cioè quei pochi nucleotidi riconosciuti dall'enzima di restrizione.

Tuttavia, assumendo a ragion veduta che i siti di restrizione siano localizzati in maniera casuale sul DNA, siccome i siti non vengono espressi come caratteri, la presenza oppure l'assenza dei siti di restrizione può venir usata per stimare le differenze della sequenza a livello generale.

Allo scopo di illustrare l’uso degli RFLP per stimare la variabilità genetica, supponiamo di isolare il DNA da 5 topi selvatici, tagliare il DNA con l’enzima di restrizione BamHI e separare i frammenti con elettroforesi su gel di agarosio. Trasferiamo adesso il DNA su nitrocellulosa e saggiamo con una sonda che riconosca il gene della b-emoglobina. Si ricordi che ciascun topolino porta due copie del gene per la b-emoglobina, una su ciascun cromosoma omologo; pertanto, un topo potrebbe essere +/+ (il sito di restrizione è presente su entrambi i cromosomi), +/- (il sito di restrizione è presente su uno dei cromosomi ed assente sull'altro) oppure -/- (il sito di restrizione è assente da entrambi i cromosomi). Su 10 cromosomi presenti in questi cinque topolini, 4 possiedono il sito di restrizione e 6 no.

Per calcolare l'eterozigosi attesa nella sequenza nucleotidica esiste una formula apposita che viene tralasciata al fine di non tediare inutilmente il lettore. Possiamo però precisare che l'eterozigosi a livello dei nucleotidi è stata studiata mediante gli enzimi di restrizione in un gran numero di organismi e che negli eucarioti varia tipicamente tra 0,002 e 0,02. Questo significa che un individuo è eterozigote (contiene cioè nucleotidi diversi sui due cromosomi omologhi) all'incirca in un caso ogni 50 ¸ 500 nucleotidi. Un altro modo di esprimere questo concetto sull'eterozigosi a livello dei nucleotidi consiste nell’affermare che due cromosomi scelti a caso da una popolazione saranno diversi per un nucleotide all'incirca ogni 50÷500.

Uno degli svantaggi di utilizzare gli RFLP per esaminare la variabilità genetica è che questo metodo rivela variabilità soltanto per un piccolo sottoinsieme dei nucleotidi che compongono un gene, in quanto isoliamo solo un piccolo campione di nucleotidi, quelli riconosciuti dall'enzima di restrizione, e usiamo questo campione per stimare il livello generale di variabilità.