Vol. 2° -  XIX.8.4.

Esplorazione del sistema HLA

Quattro vie d’approccio sono attualmente utilizzate per determinare il fenotipo e il genotipo HLA: la prima è fondata sulla sierologia, la seconda studia l’alloreattività cellulare, la terza consiste nello studio diretto dei geni HLA con RFLP, la quarta si serve dell’ibridazione utilizzando oligonucleotidi di sintesi o ancora più direttamente con determinazione della sequenza nucleotidica dopo amplificazione genica.

8.4.a. Metodi sierologici

Consistono nel valutare la reattività di anticorpi di specificità conosciuta contro linfociti del soggetto studiato. La tecnica di tipizzazione è di regola la linfocitotossicità, nella quale i linfociti sono incubati in piastre a micropozzetti con gli anticorpi anti-HLA in presenza di complemento. La citotossicità è valutata dopo aggiunta di un colorante vitale (eosina) o di coloranti fluorescenti (acridina arancio, che colora le cellule vitali, e bromuro d’etidio, che colora le cellule morte). Gli anticorpi provengono da sieri di donne multipare, di soggetti trasfusi o, più raramente, da volontari deliberatamente immunizzati. I sieri devono spesso essere adsorbiti per poterli rendere specifici. In alcuni casi si comincia ad utilizzare degli anticorpi monoclonali prodotti con la tecnica degli ibridomi. La tecnica è realizzata sull’insieme dei linfociti nel caso di antigeni di classe I, o su preparazioni linfocitarie arricchite di linfociti B per gli antigeni di classe II. I metodi maggiormente impiegati utilizzano biglie magnetiche accoppiate ad un anticorpo monoclonale anti-DR, o un passaggio su fibre di nylon.

8.4.b. Metodi cellulari

La reazione linfocitaria mista può essere utilizzata per la tipizzazione della regione D. La tecnica è complessa e i suoi risultati non si sovrappongono strettamente a quelli della tipizzazione sierologica di DR. La reazione può essere sensibilizzata utilizzando delle reazioni secondarie. Mediante il test PLT (Primed Lymphocyte Testing) si valuta la capacità delle cellule testate a stimolare una reazione secondaria di proliferazione nelle cellule precedentemente ipersensibilizzate contro cellule di fenotipo conosciuto. Questo metodo resta indispensabile per verificare l’uguaglianza tra donatore e ricevente di trapianto di midollo, e in caso di uguaglianza apparente dopo tipizzazione DR, DQ e DP.

8.4.c. RFLP

Lo studio è fondato sull’analisi, con la tecnica di Southern, di frammenti di DNA ottenuti dopo digestione con enzimi di restrizione. Questi frammenti sono separati con elettroforesi e ibridizzati con sonde specifiche dei loci DR, DQ e DP.

8.4.d. Oligotipizzazione dopo amplificazione genomica

È ormai possibile determinare precisamente ogni allele di classe II mediante ibridazione dopo amplificazione del genoma secondo la tecnica della Polymerase Chain Reaction o PCR. Con l’aiuto di un innesco specifico di ciascun locus (DRB, DOA, DQB, DPB), si amplifica un frammento di DNA corrispondente al 2° esone. Il prodotto di amplificazione è successivamente depositato su più membrane secondo la tecnica del dot blot. Ogni membrana è quindi ibridizzata con una sonda oligonucleotidica marcata, specifica di un allele o di una combinazione di un dato allele. La possibilità di utilizzare le sonde fredde rende questo metodo realizzabile di routine dove tende a sostituire la sierologia, grazie alla sua maggiore affidabilità e al suo grado di precisione migliore.

8.5. Istocompatibilità in altre specie

Nel ratto, il locus maggiore di istocompatibilità è il locus RT-1, ancora chiamato H-1 o Ag-B. Esistono anche, come nel topo, dei sistemi minori di istocompatibilità che spiegano, per esempio, il rigetto di innesti cutanei fra ratti Lewis e Fisher, che portano entrambi l’antigene RT-1. I sistemi maggiori di istocompatibilità sono stati identificati, e cominciano ad essere conosciuti, anche in numerose specie fra cui il cane (DLA), la cavia (GPLA), l’hamster (Hm-1), la capra (GLA), il montone (OLA o ShLA), la mucca (BoLA), il cavallo (ELA), lo scimpanzé (ChLA), il macaco Reso [1] (RhLA), il maiale (SLA), il coniglio (RLA) e lo xenopo [2] .

Nel Pollo il locus del gruppo sanguigno B corrisponde al locus maggiore di istocompatibilità.